血竭是龙血树属植物受伤后所产生的红色树脂。血竭作为一种传统药材应用历史悠久，但其形成机制却不甚明了。查尔烷型聚合物是血竭中的主要成分，迄今为止已从血竭中报道该类聚合物超过50个。本研究证明这类聚合物形成的关键步骤是对亚甲基苯醌介导的非酶催化的迈克尔加成反应。龙血树中的两个二氢黄酮醇还原酶：DcDFR-1和DcDFR-2，负责催化还原二氢查尔酮产生对亚甲基苯醌的前体——查尔烷醇。此外，本研究利用对亚甲基苯醌的化学活泼性合成了一系列结构多样的聚合物。本文不仅为揭示血竭的形成机制奠定了基础，也为查尔烷型聚合物的绿色合成提供了简洁的方法。

亚甲基苯醌（Quinone methides, QMs）是一类化学性质活泼的中间体（图1A），能与不同类型的亲核试剂发生迈克尔加成反应，在有机合成领域应用广泛。近年来，在天然产物的生物合成途径中也发现了QMs的存在。例如，从penilactone A的生物合成途径中发现的一个邻亚甲基苯醌（o-QMs，图1B），另外fluostatins二聚体形成也由一个对亚甲基苯醌（p-QMs）介导（图1C）。由此可见，除酶催化的聚合反应之外，QM介导的迈克尔加成反应也是天然聚合物形成的一种潜在的策略。寡聚化合物在自然界尤其是植物中普遍存在，但是有关聚合物生物合成的研究并不多见。有一类查尔烷型聚合物主要存在于龙血树受伤后形成的红色树脂（血竭）中（图2A），在健康的龙血树中并未发现，在其它植物中也非常罕见，并且这类聚合物的形成机制此前未有任何报道。虽然这类聚合物结构多样，但是都有以下三个共同点：（1）聚合物的结构中都有一个查尔烷结构片段，（2）连接两个结构片段的位置相对固定，（3）连接两个结构片段的手性碳没有立体选择性。基于此，本文作者推测这类聚合物的形成是QM介导的非酶促反应的结果。

图 1. (A) p-和o-QM的结构；(B和C) QM介导的天然产物生物合成。

为了验证这一猜测，本文首先通过化学还原的方法将查尔酮1还原成查尔烷醇2（图2B）。2在水溶液中可能通过自发地脱水产生p-QM (3)。由于3是不稳定的中间体，难以直接捕获，因此作者首先将2分别溶解于H2O和H218O中在25 °C中培养24 h，然后利用质谱观察18O是否可以进入2结构中。实验表明18O可以从水中进入2，因此间接确证了2和3互变的存在。接下来，作者以cochinchinenene D (P1)为例来验证其是否可以在温和的条件下通过3自发形成。将白藜芦醇(R1)和查尔烷醇2（终浓度为1 mM）在25 °C培养24 h之后，通过LC-MS分析发现反应体系中有一个明显的产物峰形成（图2C）。该峰显示为m/z为483.1840的[M-H] –峰，与预测的分子式C30H27O6–吻合。通过将该反应体系扩大、在pH3的KPi溶液中培养2天后并经过分离纯化成功获得该产物的纯品，其结构通过波谱解析确定为P1。此外，本文测试了p-QM与不同类型的亲核试剂反应的潜力。为了避免3发生分子间二聚从而形成副产物，本文作者选择了3的一个类似物6（两者仅在其中一个苯环的取代基上有区别）。查尔烷醇5作为6的前体也是通过上文类似的方法通过还原查尔酮4获得（图3A）。本文测试了5与黄酮类化合物、氧化白藜芦醇、间苯三酚、phloroglucide、酚酸类化合物、香豆素、萘酚类化合物、喹啉类化合物、以及吲哚类化合物的反应活性，LC-MS结果显示反应混合物中均有产物形成。通过优化反应条件、扩大反应体系也确定了其中部分产物的结构（图3B）。因此，该结果证明，除了P1，血竭中的其它查尔烷型聚合物的形成均有可能是QM介导的非酶促反应的结果。

图2. (A) 血竭中的查尔烷型聚合物代表性结构；(B) 查尔酮1的还原产物查尔烷醇2通过p-QM (3)与R1发生聚合反应；(C) R1与2反应的LC-MS 分析结果。

图3. (A) 查尔酮4还原形成查尔烷醇5；(B) 6与不同亲核试剂反生聚合反应的产物结构。

接下来，本文作者进一步探究了p-QM (3)的天然来源的问题。尽管以上实验已经证明3可以经由查尔烷醇2自发脱水而得，但是2在自然界中并没有被报道过，这很有可能是因为3的活泼性使得2难以通过传统的分离纯化手段获得。但是2的前体查尔酮1（又名刺甘草查尔酮，echinatin）和二氢查尔酮7（又名龙血素C，loureirin C）却均作为天然产物在植物中报道过。因此，我们推测2是以二氢查尔酮7经酶催化还原的产物。尽管目前还没有负责催化还原查尔酮7的相关酶的报道，但是已有文献报道二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonol-4-reductase, DFR)催化还原二氢黄酮醇比如dihydrokaempferol (DHK)，dihydroquercetin (DHQ)，和dihydromyricetin (DHM)等，甚至有的DFRs具有底物宽泛性，不仅能还原二氢黄酮醇，还能还原黄烷酮。基于二氢黄酮醇、黄烷酮、及二氢查尔酮的结构相似性，本文作者选择了苹果(Malus domestica)中一个已知的DFR（命名为MdDFR）来测试其是否具有二氢查尔酮还原酶活性。结果表明，与阴性对照相比，加酶的实验组有明显产物峰的形成，且保留时间与产物标准品一致（图4A）。当以二氢查尔酮8为底物时，反应体系中也有还原产物5的形成（图4B）。在确证了MdDFR的二氢查尔酮还原酶活性之后，本文作者继续在龙血树中寻找MdDFR的同源候选基因。根据先前报道，对化学诱导处理的海南龙血树(Dracaena cambodiana)的茎中与黄酮生物合成相关基因进行转录组分析显示，有7个DFR基因有不同程度的上调，其中有两个DFR与MdDFR的氨基酸序列相似度较高（DcDFR-1为63%，DcdFR-2为64%）。因此，本文对DcDFR-1和DcDFR-2开展了进一步的生化表征实验。结果表明，与MdDFR类似，DcDFR-1和DcDFR-2均具有还原二氢查尔酮的能力，分别可以将底物7和8还原成产物2和5 (图4)。

图4. 以dihydrochalcone-M272 (A) 或dihydrochalcone-M226 (B) 为底物，分别与MdDFR，DcDFR-1，和DcDFR-2培养的酶反应体系的LC-MS分析结果。

综上所述，血竭中的查尔烷型聚合物是p-QM介导的非酶促的迈克尔加成反应的结果，而p-QM的产生归因于DFR催化还原二氢查尔酮产生查尔烷醇。DFR是黄酮生物合成中非常常见的一类酶，而本文从海南龙血树中鉴定的两个DFR：DcDFR-1和DcDFR-2显示了对二氢查尔酮的底物偏好性和催化的立体选择性。综合前人报道的结果，本文推导了查尔烷型聚合物的生物合成途径（图5）：该途径经查尔酮合酶(chalcone synthase, CHS)，查尔酮还原酶(chalcone reductase, CHR)，以及查尔酮异构酶(chalcone isomerase, CHI)催化形成(S)-liquiritigenin之后，再由一个与CYP93G5类似的P450负责催化(S)-liquiritigenin的2位羟基化。2位羟基化的(S)-liquiritigenin经过半缩醛开环形成licodione，该化合物是形成查尔酮1的前体。值得注意的是，1不是典型的查尔酮，而是“反式”查尔酮—与典型的查尔酮相比A环和B环的位置相反。同样，二氢查尔酮7也是“反式”二氢查尔酮，因此不太可能像典型的二氢查尔酮一样以香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A为前体由CHS催化所得。有趣的是有文献报道包括镰刀菌在内的许多微生物均能将查尔酮转化为二氢查尔酮，而镰刀菌在血竭的形成过程中扮演着重要角色，有研究表明在龙血树的受伤部位接种层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)之后血竭的产量有所提高。本文作者将查尔酮1和4分别喂养到F. culmorum和F. proliferatum的培养基中，结果表明在两株镰刀菌的发酵提取物中，查尔酮1和4均有消耗，而7和8均有新增，说明镰刀菌不仅能还原“正常”查尔酮，也能还原“反式”查尔酮，因此微生物的参与在“反式”查尔酮到二氢查尔酮的转化过程中发挥重要作用。

图5. 龙血树血竭中查尔烷型聚合物的生物合成途径推导。

中国热带农业科学院热带生物技术研究所廖格博士和湘南学院米承能博士为本文共同第一作者；深圳湾实验室化学生物学研究所唐啸宇特聘研究员、中国热带农业科学院热带生物技术研究所戴好富研究员和梅文莉研究员为本文共同通讯作者。

原文信息：

p-Quinone Methide-Mediated Nonenzymatic Formation of Chalcane-Containing Dimers in Dragon's Blood