在瞬息万变的生命世界里，每一个生物分子都在演绎着自己的故事。它们或在细胞质里游走，或在细胞器中穿梭，其行为往往蕴含着生命活动的关键线索。在生命科学领域，观测高速运动的生物分子如同用肉眼追踪子弹轨迹般困难。单分子动态研究则像是给每个分子都装上一台“摄像机”，让我们能够实时追踪它们的运动轨迹、停留时间和环境变化。这些细节往往是理解生命基本规律、揭示疾病发生机制、乃至设计新型药物的关键。

近日，深圳湾实验室侯尚国团队等成功研发出三维目标锁定单分子光谱动态显微镜（3D-SpecDIM），实现对生物分子三维运动轨迹与化学特性动态变化的同步捕捉。该项研究在《自然通讯》（Nature communications）杂志在线发表（图1）。这项技术给生物分子装上“GPS + 验金笔”，实时锁定并追踪细胞中高速运动的单个分子，同时捕捉它发出的荧光光谱（颜色）如何随着微环境改变而变化。这意味着我们第一次能够一边“看到”分子在活细胞内的三维运动轨迹，一边同步监测到它所处环境的化学变化信号——一种传统显微镜难以实现的突破。借助这一利器，研究团队成功观测了细胞内线粒体自噬（细胞清理受损“动力工厂”的过程）过程，以及细胞膜起泡时膜分子的性质变化，为生命科学研究开启了前所未有的新窗口。

图1

技术突破：给分子装上“动态GPS+验金笔”，显微镜如影随形地跟拍分子

想要在单分子层面同时“看清”位置和环境绝非易事。以往，当研究者尝试观察活细胞内的分子活动时，一个常遇到的问题是：目标分子跑得太快、范围又是立体的，普通显微镜很快就跟丢了。比如，在显微镜视野里分子一会儿跑出焦点、一会儿又运动过快导致图像拖影模糊。这就像试图用长焦镜头拍摄一只来回疾飞的萤火虫——还没对准焦点，它可能就飞走了，照片只留下模糊的光迹。而3D-SpecDIM系统巧妙地解决了这一难题：它利用“靶向锁定”的3D追踪技术，实时调整显微镜的焦点和视野位置，始终让目标分子处在“镜头中央”。通俗来说，相当于给显微镜装上了高速自动跟踪云台，无论分子在三维空间怎么动，系统都能如影随形地跟拍，不让它逃出视野。

实现这一点靠的是高速反馈控制和智能光学设计（图2）。研究人员将激光光源通过一系列快速响应的光学元件进行控制：微小的电光偏转器充当“迅捷转镜”，能在微秒级调整激光照射的位置；可调声光透镜则如“快速对焦镜头”，即时改变焦点深度。这套装置实时感知分子发出的光信号所在的位置，并驱动激光束跟随瞄准，实现对单个目标的锁定照明。形象地比喻，就好比在漆黑森林里用手电追踪一只飞舞的萤火虫，3D-SpecDIM就是那支拥有自动瞄准功能的手电筒，时刻让萤火虫停留在光束中心。正因为有了这一“锁定”机制，再快的分子运动也难不倒，它不会再轻易溜出观察视野。

图2 3D-SpecDIM 装置原理图

与此同时，3D-SpecDIM并非只拍摄分子的亮度变化，还将一个光谱成像单元整合到探测光路中，能够解析出分子发光的颜色细节。我们知道，荧光分子的发光颜色（光谱）蕴含了丰富的信息：稍微发红或发蓝，可能意味着分子周围环境的酸碱度、极性等理化性质发生了变化。然而传统显微成像获取光谱通常需要逐波长扫描，过程较慢。为了解决这一瓶颈，研究团队在3D-SpecDIM中引入了一个小棱镜，将单分子发出的微弱荧光 “拆解”成彩虹般的光谱，在高速相机上同时记录。如此一来，每一帧影像不仅有分子所在的位置点，还有旁边拉开的彩色光谱条纹，瞬间捕获了该分子的详细光谱信息，而无需逐点扫描。更棒的是，他们还借助人工智能算法提高了读谱精度——训练了一个深度学习模型来识别这些微弱的光谱信号，就像训练AI去辨认模糊的彩虹哪种颜色最亮。这使得即使在单分子发光很弱、光子很少的情况下，系统也能迅速而准确地读出光谱峰值等关键信息。综合以上设计，3D-SpecDIM达成了同步获取分子“三维轨迹+光谱颜色”动态的能力。换言之，这台显微镜不仅能看到分子在哪里，还能感知到分子当时周围环境怎样了，真正实现了位置和光谱信息的双管齐下。这相当于给分子装了“运动手环+化学传感器”，我们能看到它们在细胞内的‘舞步’和‘情绪变化’。

那么，这样的“追光捕色”显微技术能为生物研究带来什么新发现？研究人员用两个生动的实验给出了答案。

1）线粒体“回收”现场直播

线粒体自噬是细胞清理损伤线粒体的重要机制，简单来说，细胞会用囊泡（自噬体）包裹住受损的线粒体，运送到溶酶体中进行降解回收。如果把细胞比作城市，线粒体就是“发电厂”，而溶酶体就是“垃圾处理站”，线粒体自噬就是把损坏的发电厂拆解丢进垃圾站的过程。这一过程动态而复杂，涉及线粒体、自噬体、溶酶体三个成分在细胞中移动结合。传统显微镜因为景深有限，很难持续跟踪到一个具体线粒体被吞噬的全程。但借助3D-SpecDIM，研究人员锁定了一只正在被清理的线粒体“动力厂”，连续不断地记录下它在细胞内的运动轨迹以及周围化学环境的变化。他们给线粒体标记上了一种pH敏感的荧光探针：该探针由两种荧光物质组成，一个对酸碱度变化很敏感（酸性增强时荧光减弱），另一个则相对稳定，用前者与后者的发光强度比值就可以指示线粒体所处环境的酸性强弱。在实验中，通过3D-SpecDIM的光谱解读功能，研究者实时计算出了这一比值随时间的变化。当线粒体被运往溶酶体时，探针的荧光颜色比例发生显著变化，清晰地显示出线粒体所处环境正变得越发酸性。特别是在进入溶酶体时，酸度跃升，探针比值陡降，说明线粒体掉进了溶酶体的强酸池——这一刻3D-SpecDIM捕捉得一清二楚。更难得的是，研究团队还利用一种“多分辨率成像”策略同步获取了细胞内溶酶体的三维分布图像。简单来说，就是在追踪线粒体的同时，对全细胞的溶酶体进行了三维成像，然后将单个线粒体的运动轨迹叠加在这个细胞“地图”上来看。结果显示，那条被锁定跟踪的线粒体轨迹准确地贯穿进了一个溶酶体的位置，并在其中发生了pH骤降。这种多尺度结合的直观画面，就如同在GPS地图上描绘出一辆车穿过城市并最终开进指定车库的路径，让人第一次直观看到线粒体自噬发生时，线粒体移动的路线以及被消化分解的空间位置。

图3 3D-SpecDIM用于在活细胞中实时监测线粒体自噬

2）量化细胞膜“吐泡泡”过程

细胞膜起泡（膜出芽/鼓泡）是指细胞膜表面鼓起一个个小泡的瞬态过程，有时发生在细胞运动、分裂或受损时。别看它尺度小、持续时间短，这一过程在细胞凋亡等生理过程中扮演重要角色。然而要抓住起泡发生时膜分子性质的变化，以往也非常困难：传统光谱显微技术采集光谱速度跟不上这种转瞬即逝的过程，空间上也只能提供平面信息，不易看清膜泡的立体动态。3D-SpecDIM再次大显身手。研究人员让细胞摄入了银纳米颗粒（直径约100纳米），这些颗粒附着在细胞膜上，可以视作给膜“绑”上的微小标记物。然后用蓝色激光激发细胞膜上名为尼罗红（Nile Red）的荧光染料。这种染料有个特殊本领：它对周围环境“极性”（可理解为环境的化学极性/亲水亲油程度）很敏感，环境极性不同，它发出的荧光颜色会有细微偏移。当蓝光照射引发细胞膜起泡时，3D-SpecDIM一边锁定追踪着那颗附着膜的小银粒在三维空间的剧烈运动，一边即时捕捉尼罗红荧光光谱的变化。结果非常有趣：每当膜泡鼓起时，小银粒被明显向上推起（证明膜在局部鼓出了一个小泡），同时探测到尼罗红的荧光光谱峰值在缓缓滑向短波方向（也就是颜色略微变蓝了）。颜色变蓝意味着什么呢？根据尼罗红的特性，这表明膜局部的化学环境变得更偏疏水（极性下降）。通俗理解，可以想象原本细胞膜所在的环境像“水油混合物”，而鼓起的膜泡内部更趋向于“油性”的环境，所以染料颜色发生了变化。研究人员首次定量实时观察到细胞膜起泡伴随的膜化学性质改动：膜泡越大，荧光峰位下降越明显。相反，在未发生起泡的对照细胞中，银粒的位置和荧光光谱几乎没有显著变化，说明只有当膜真正鼓出泡时才出现这种光谱偏移。3D-SpecDIM高时空分辨的光谱追踪让研究者能够捕捉这一细微现象，并测量出膜极性改变的速率约每分钟0.65 nm（以荧光峰波长变化计）。此外，利用这一系统，他们统计发现膜泡多发生在细胞边缘区域，出现频率比细胞中心高约1.75倍，并测定了膜泡形成的大致时间尺度（平均约5.3分钟）。这些数据都是以前难以获取的。由此可见，3D-SpecDIM不但让我们“看到了”细胞膜起泡这种动态事件的三维过程，更量化了其中的生化变化，为深入理解细胞膜力学和生物物理过程提供了宝贵信息。

图4 3D-SpecDIM用于量化细胞起泡过程

不仅是显微镜，更是生命过程的“多参数监测站”

3D-SpecDIM为生命科学和生物成像领域提供了全新的研究手段。以往我们研究细胞过程，常常要在“位置动态”和“生化信息”之间做选择：要么看清运动轨迹，要么测到化学变化，很难两者兼得。而这套新技术打破了这一壁垒，使科研人员能够在同一时间尺度下获取多种参数动态。从上面的实验可以看到，它能够提供传统技术难以企及的完整图景：例如线粒体自噬中，不仅知道线粒体去了哪儿，还知道它何时进入酸性环境；再如细胞膜起泡中，不仅看到膜鼓出了多高，还检测到膜分子属性随之如何改变。这种 “一举两得”的观测能力将为生命科学带来诸多新可能。

值得强调的是3D-SpecDIM的高度灵活性。尽管目前展示的是荧光分子的光谱成像，它实际上也适用于非荧光的散射光谱动态成像，这意味着即使不加入荧光标签，一些纳米粒子本身的散射特征也能被追踪和分析。例如，在材料科学和化学领域，可以用它来跟踪催化反应中的纳米颗粒，实时监测其表面等离子体共振光谱如何变化，从而揭示反应动力学过程。进一步地，这一系统还可扩展到拉曼光谱成像，将来有望实现对单颗粒的3D轨迹和拉曼指纹同时获取。拉曼光谱能够提供分子结构和成分的信息，如果与3D追踪结合，意味着连化学组成变化都能一并监测。由此可见，3D-SpecDIM提供的是一个通用平台，可以根据研究需求选择不同类型的光谱信号进行动态成像，一机多能，在生物、化学等众多领域都有广阔的应用前景。3D-SpecDIM作为一台“分子摄像机”，让我们终于能够追光逐影，窥见那原本隐藏在瞬间中的生命奥秘。

深圳湾实验室正积极推进该技术转化，其首台命名为“Hyper-SMART”的原型机（图5）已研制成功，有望在未来几年内服务于更多实验室。

图5 原型机实物图

深圳湾实验室侯尚国研究员与哈尔滨工业大学（深圳）张永兵教授为论文共同通讯作者。深圳湾实验室和哈尔滨工业大学（深圳）联培博士研究生沙浩、深圳湾实验室博士生吴宇和张永兵教授为共同第一作者，深圳湾实验室博士生刘冉参与本项研究。此研究得到了深圳市医学研究专项（B2301003）、国家自然科学基金（22204106、62031023、62331011），深圳市科技项目（GXWD20220818170353009），仪景通-深圳湾实验室光学成像技术开发项目（S234602004-4），以及广东省珠江人性项目的支持。

深圳湾实验室侯尚国课题组研究方向包括多维动态光学显微成像技术开发、病原体与宿主相互作用机制、定量生物分子动态成像和人工智能生物成像。课题组常年招收光学、电子信息、计算机科学、细胞生物学等相关专业博士研究生、博士后、研究助理、助理研究员等。欢迎感兴趣的优秀青年联系，课题组网站https://houlab.szbl.ac.cn/，具体招聘详情请查看深圳湾实验室网站招聘网页。

原文信息：

Single molecule spectrum dynamics imaging with 3D target-locking tracking

文章来源|侯尚国课题组

编辑|鲍 鲍

责编|远 山

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