新冠病毒从2019年末开始流行肆虐至今，持续了3年时间，已经造成4.5亿人次感染，超600万死亡病例，纵观人类历史，除了少数几次病毒大流行以外，很少有一场疫情可以持续如此长的时间。近期在深圳市局部流行的新冠病毒为最新的奥密克戎变异株，其具有传播力强、传播速度快、隐匿性高、人群普遍易感等特点，给疫情防控工作带来更为严峻挑战。
新冠病毒经历了怎样的遗传进化之路？它是如何不断进化突变，来维系自身在宿主间的高效传播？疫苗接种作为防控病毒传染病最普适性的手段，不同种类疫苗有何优缺点？如何接种才能高效避免感染？
近日深圳湾实验室特聘研究员刘洋在Bioart与一作面对面论坛分享题为“新冠病毒变种和疫苗接种”的报告，以下为演讲实录：
新冠病毒的遗传进化
近年来，全球范围内各类传染病疫情不断暴发，严重威胁国民健康。这些传染病的病原体多为高致病性、高重症率、高致死率的病毒，比如登革病毒、寨卡病毒、黄热病毒、埃博拉病毒、MERS和SARS-CoV-2。它们的流行造成了数以亿计的感染和数百万人的死亡。WHO最新公布的8种最需要关注的传染病也均由病毒传播，包括了2种呼吸道传播病毒MERS和SARS-CoV-2，3种虫媒传播病毒克里米亚刚果出血热，裂谷热和寨卡；两种通过密切接触传播的尼帕病毒和拉沙热病毒，以及感染能力极强的直接接触传播的埃博拉病毒。可以预见，在未来的数十年里，病毒类传染病将会成为，对人们健康的最重大威胁之一。
新冠病毒从2019年末开始流行，并肆虐至今，持续了3年时间，已经造成4.5亿人次感染，超600万死亡病例；各类突变病毒毒株层出不穷，对人们健康造成了极大威胁。纵观人类历史，除了少数几次病毒大流行以外，很少有一场疫情可以持续如此长的时间。新冠病毒在流行的过程中，不断的适应人类宿主，增强自身的感染和传播。
当人体被新冠病毒感染后，一般在2-3天以后产生临床症状，轻症患者主要表现为发热、全身乏力疼痛，有时会伴随着腹泻等胃肠道反应；新型的Delta和Omicron突变株的临床症状更为轻微，有时甚至无法感知到明显的身体不适；轻症患者一般在1-2周后会自愈。而新冠肺炎的重症患者会出现急性呼吸窘迫综合症，造成胸闷和呼吸困难，进而导致脓毒性休克和凝血功能障碍，从而危及生命。
新冠病毒属于冠状病毒科，是典型的包膜病毒，其基因组为正义链单链RNA，长度大约为30kb，编码了4个结构蛋白和若干非结构蛋白。其结构蛋白包括了刺突蛋白S，膜糖蛋白E，小包膜蛋白M和衣壳蛋白N。其中，刺突蛋白像棘突一样凸起在病毒的外表面，是介导新冠病毒与受体结合，以及病毒侵入细胞的关键蛋白。病毒的衣壳蛋白N主要与病毒的基因组结合，协助病毒正确的组装。M蛋白也是一种穿膜蛋白，和S蛋白不同，其隐藏在细胞膜上，共同组成病毒表面的膜结构。而E蛋白则参与形成病毒膜表面的离子通道，影响病毒的活性。另外，病毒编码的多个非结构蛋白，则主要参与病毒自身的复制和对宿主免疫反应的调控。
新冠病毒最早在中国武汉被发现，有关病毒的起源有各种各样的阴谋论。但从科学的角度来分析，越来越多的动物被证实可以携带和传播新冠病毒。在蝙蝠和穿山甲身上分离到的冠状病毒和新冠病毒的受体结合区域高度类似，且具有进化上的时序性；而对这些冠状病毒刺突蛋白S1和S2亚单位切割位点的分析也表明，新冠病毒特异性的PRRA插入突变，在云南菊头蝠冠状病毒上也天然存在。这些证据表明，蝙蝠和穿山甲很可能是新冠病毒的自然界的动物宿主。
新冠病毒属于典型的呼吸道传播病毒，其主要依靠直接接触时的空气飞沫，以及新冠患者呼吸时产生的气溶胶的传播。同时有证据表明，新冠病毒很可能还存在着从物到人的接触传播。由于我国的动态清零的新冠防控策略，人与人接触的传播链条可以被精确回溯。在我国发生的多起疑似新冠病毒“物传人”的疫情中，当地的其它病例已经动态清零，感染者和已有病例没有接触；遗传溯源发现这些毒株和当地流行的病毒有着显著性差异，却和境外毒株高度相似。同时，从冷链运输的物品上也分离出了活的新冠病毒。这些流行病学证据指向，新冠病毒极有可能存在由物传播到人的传播途径。
新冠病毒是RNA病毒，其基因组缺乏稳定的复制纠错机制，病毒发生突变的频率很高。伴随着病毒的流行，病毒和宿主间相互适应，一些有利于病毒感染和传播的突变会被自然选择筛选出来。在这里需要指出的是，对于病毒来说，其生存策略是为了维持自身在自然界的延续，杀死宿主对病毒并没有好处。如果给病毒足够长的时间和宿主协同进化，最终它们会达到一种平衡。从旁观者的角度来看，病毒的对宿主的致病能力会慢慢变弱，但传播能力在不断变强，当前新冠病毒的进化趋势就符合这一特征。研究病毒的遗传进化，寻找并鉴定其中的重要突变，有着极其重要的基础科研和转化应用意义。它可以帮助我们理解病毒的致病机理，分析病毒的进化规律，预警病毒潜在的爆发和流行；也可以帮助我们改进各类病毒基因工程学工具和疫苗策略，提供新的抗体和药物的靶点。因此，我们的科学问题就是，新冠病毒是如何不断进化突变，来维系自身在宿主间的高效传播？哪些重要的突变位点可以增强病毒的感染和传播。
新冠病毒流行至今，产生了很多不同的变种病毒，其中最有代表性的变种病毒包括新冠病毒Alpha株，最早在英国被鉴定；Beta株，最早在南非被发现；Delta株在印度起源，并扩散至全球；Gamma株，在南美洲巴西当地广泛流行。以及最新出现的Omicron株，2021年底于南非出现，并迅速席卷全球。当我们对不同毒株的病毒序列进行生物信息学比对，可以发现很多不同的氨基酸突变，但并不是所有的突变都会具有生物学功能。在生物的遗传进化中，由于奠基者效应等遗传漂变现象，很多对病毒没有作用，甚至有害的突变也会在自然界中出现，甚至达到相当高的基因频率。我们必须通过生物学实验，对这些突变位点进行逐一验证，才能了解它们的生物学功能。
那么我们如何对这些突变进行实验验证呢，就必须借助到反向遗传学系统。我们会通过反向遗传学手段，将特定的突变引入到病毒的基因组中，再去评估突变发生后，病毒感染能力的变化。对于新冠病毒的的研究，有很多反向遗传学系统被广泛应用，包括假病毒系统，病毒的亚复制子，病毒样颗粒VLP系统，反式互补系统和活病毒系统。这些系统各有优劣，有些只能对病毒感染复制过程中的某一个特定的环节进行针对性的评估，比如假病毒系统就只能研究病毒和细胞表面受体的结合和病毒在细胞上的进入过程；病毒亚复制子只能研究病毒在细胞内的复制和扩增。野生型活病毒是临床检测、药物筛选和抗体评估的“金标准”；但是对于高致病性的病毒，需要高等级的生物安全设施以及专业人员，操作难度和安全性风险较高。图1展示的是一个新冠病毒野生活毒系统，将新冠病毒基因组分为7段分别扩增，再连接成一个整体；随后进行病毒基因组RNA的体外转录，在细胞上拯救包装出活病毒。我开展的新冠病毒的遗传进化研究，就是基于这个活病毒系统进行操作。
图1
之前的介绍中已经提到，新冠病毒表面的spike刺突蛋白，是介导病毒在细胞上吸附和侵入的重要蛋白；当新冠病毒传播到一个新的宿主时，快速的识别结合，并侵入靶细胞是建立早期感染的关键步骤。同时，刺突蛋白也是新冠病毒表面最主要的抗原，人体在新冠疫苗接种或者被病毒感染后，产生的抗体基本都是针对刺突蛋白发挥作用。新冠病毒刺突蛋白发生的突变，最容易影响新冠病毒感染和传播能力，也是病毒逃逸宿主抗血清识别的关键。因此，我的研究主要是围绕新冠病毒的刺突蛋白展开。
在新冠病毒2020年开始流行后不久，流行病学的数据分析就发现，新冠病毒刺突蛋白的第614位氨基酸出现了从天冬氨酸D到甘氨酸G的突变，这一突变的在自然界中的基因频率飞速上升，表明该突变极有可能影响病毒的感染。我们使用了人肺部上皮细胞组织模型，通过竞争实验对这一突变的功能进行验证。竞争实验，就是模拟病毒在自然界中真实进化角逐的过程，将不同突变病毒置入同样的感染系统中，通过检测不同变种病毒数量的比例来判断哪一种突变病毒在进化中占据优势。我们的实验发现，新冠病毒刺突蛋白D614G突变会非常显著的提高病毒在人肺部上皮细胞中的感染和复制能力。
同时，在仓鼠等动物模型上的的研究结果也证明了，D614G病毒在动物的鼻腔和上呼吸道中具有更强的复制能力，从而促进病毒的传播和扩散。目前新出现的各类新冠病毒变种都具有D614G位点突变，G614的基因频率已经达到了接近100%。这项研究在当时前瞻性的预测了，D614G突变在病毒遗传进化上的优越性，并解释了其促进传播的机制。
在之后的另外一项研究中，我们发现2020年底英国出现的新冠病毒的alpha毒株，其致病和传播能力都要强于原始的毒株。我们通过反向遗传学手段，将alpha毒株上的8个标志性氨基酸位点逐一突变，再使用仓鼠传播模型，进行竞争实验去评估突变病毒传播能力的变化。我们将突变病毒和野生型病毒混合，通过鼻腔接种让供体仓鼠感染；在病毒感染供体仓鼠一天后，再将干净的受体仓鼠和感染的供体仓鼠共同饲养8个小时，让病毒自然的在动物间进行传播。 随后，我们对供体和受体仓鼠的鼻腔洗涤液，气管等组织中的突变病毒和野生病毒的比例进行检测。 结果表明只有具有刺突蛋白N501Y突变的病毒，在仓鼠的鼻腔和气管中均保持显著的竞争优势。
随后的机制实验表明，刺突蛋白N501Y突变，会大幅度增强病毒和其重要细胞表面受体ACE2的结合，从而促进病毒对细胞的早期感染，加速病毒在自然界中的传播和扩散。这项研究鉴定并证明了新冠病毒刺突蛋白N501Y突变对病毒流行的重要促进作用，并解释了其分子机制。最近Omicron变异株疯狂流行，当Omicron突变株首次出现时，我们发现其携带了N501Y突变，就预测该毒株传播和扩散的能力会数倍于其它突变株。尽管全球各国政府第一时间将针对Omicron的戒备级别提升到最高，但是由于Omicron病毒在南非发现的太晚，已经在欧美隐性扩散开来，Omicron变体在全球的大流行不可避免。
除了我们重点研究的刺突蛋白D614G和N501Y突变以外，刺突蛋白上其它的氨基酸突变也在病毒的感染和免疫逃逸中发挥重要的作用。图2表格汇总了其中一些重要的氨基酸突变，可以看到，其中的相当一部分免疫逃逸相关的突变都出现在了最新的Omicron突变株上，这也是Omicron株能够显著性逃逸宿主抗血清和大量中和性单克隆抗体识别的关键。
图2
除了对自然界中已有的突变位点进行的研究，我们也同样关注病毒未来的进化方向。根据已有的病毒遗传进化的数据，我们尝试借助大数据分析，人工智能深度学习等手段分析病毒的遗传进化的规律，建立病毒进化预测模型，前瞻性预测病毒未来可能出现的高危突变，对这些潜在突变的生物学功能进行验证。我们的目的，是能够预警未来病毒高危突变位点，当流行病毒学检测到高危突变出现时，能够及时的提高防控等级，将潜在的病毒流行掐灭在萌芽中。
新冠病毒的疫苗策略
疫苗、抗体和各类大分子/小分子药物是防控病毒感染的重要手段。其中，疫苗接种可以预防病毒的感染，阻断病毒在人群中的传播和扩散，是防控病毒传染病流行最普适性的手段。
传统的疫苗种类包括灭活疫苗、减毒疫苗，蛋白亚单位疫苗等，而新型的疫苗策略则有病毒载体疫苗，DNA和RNA等核酸疫苗等。如新冠病毒腺病毒疫苗，就属于病毒载体疫苗。各类不同疫苗策略都具有各自优缺点，在新冠疫苗的研发中，多种疫苗策略都被广泛使用。比如，国内更多的是使用了经典的灭活疫苗，而欧美更早使用了新型的mRNA疫苗。
mRNA疫苗策略在此次新冠疫情中正式登上舞台，并在疫情防控中起到重要的作用。与常规疫苗相比，mRNA疫苗具有相对成本低、生产效率高、安全性高的优势。目前欧美应用最广泛的是辉瑞公司BNT162b2疫苗，它是以新冠病毒全长刺突蛋白为抗原的新型mRNA疫苗策略。我国在mRNA疫苗领域起步较晚，尤其是在核酸疫苗递送系统和国外相比具有明显的劣势，但现在也正在迎头赶上，国内有多个mRNA疫苗即将进入临床实验阶段。
辉瑞mRNA疫苗使用的是最原始的USA-WA1/2020新冠病毒的刺突蛋白作为抗原。新冠病毒在流行的过程中产生了不同的变种病毒，评估已有疫苗产生的抗血清对变种新冠病毒中和能力的变化，可以为疫苗的后续改进提供重要的信息。当变种新冠病毒出现后，我们将变种新冠病毒的全长刺突蛋白，构建到原始的USA-WA1/2020骨架上，拯救出嵌合病毒。这些重组病毒有着相同的骨架，从而具有相近的病毒复制和扩增效率，可以稳定均一的评估抗血清对不同变种病毒中和能力的变化。实验表明，在Omicron毒株出现之前，两次免疫人群产生的抗血清对多个变种病毒的中和能力虽稍有下降，但都在正常的变动范围内。
而两次免疫人群的抗血清，对Omicron株的中和效率发生了显著性的下降；提示仅仅进行两次疫苗接种，不足以保护Omicron变异毒株的感染。而后续的实验表明，当对人群再进行第三次加强免疫后，其抗血清对Omicron毒株的中和能力虽然比不上原初毒株，但已经能够达到相当高的保护水平。这一实验结果表明，即使是使用原初病毒的刺突蛋白设计的疫苗，在进行多次强化免疫后，也能够防护Omicron变异株的感染。同时，各种临床数据也表明，疫苗接种人群在被包括Omicron在内的各种新冠变种病毒感染后，其重症率和死亡率均有非常明显的下降。这些证据指向，在全球进行大范围的接种和加强免疫，依然是防控新冠疫情的最直接有效的手段。
人类历史上的每一次大疫情流行，都改变了历史的进程。新冠病毒正在不断刷新人类的认知，而我们和疫情的斗争也依然会继续下去。新冠疫情未来的走向是大家都非常关心的事情，自从疫情暴发以来，已经过去了3年时间，人们似乎已经适应了与病毒同在的日子。根据以往传染病疫情暴发的规律，在全球绝大多数人完成了主动免疫，或因感染被动免疫后，疫情的浪潮在达到巅峰后会迅速消退。新冠病毒借助自身的快速突变，可以在一定程度上逃逸人类已经产生的抗血清的识别和中和，但终归也无法摆脱传染病的一般规律。未来要么疫情逐渐退潮，只剩下零星的区域性感染，最终像SARS一样完全消失；要么病毒逐渐弱化，只对人类造成轻微伤害，像流感一样达成和人类的共存。无论那种情况，生活都会归于平静。作为病毒学家，我们的眼光已经不再局限于现在的新冠疫情，而是要关注更遥远的将来，我们需要吸取这次新冠疫情的经验，完善各种预测和应对的手段，时刻警惕好下次未知的新型病毒传染病的突然流行，希望能够在疫情发生的最初阶段就发现并进行干预，将疫情扼杀在摇篮中。
刘洋博士于 2006 年获得复旦大学生命科学学院生物科学学士学位，2018 年获得清华大学生命科学学院生物学博士学位，其聚焦蚊虫媒介烈性黄病毒和宿主间的协同进化， 鉴定出多个蚊虫和病毒上影响黄病毒感染的重要因子，并开发了针对性的传播阻断疫苗，2 次获得博士研究生国家奖学金，并获得 2018 年吴瑞奖学金。2018 年底，刘洋博士加入美国德克萨斯大学医学部（UTMB）史佩勇教授课题组进行博士后研究，继续关注病毒进化和疫苗开发，期间阐明了寨卡病毒进化中获得的多个重要突变的功能。刘洋博士发现并验证了新冠病毒上多个促进病毒感染和传播的重要突变，搭建了多种研究新冠病毒的重要反向遗传学平台，并在世界上首次评估了新冠疫苗对多种突变新冠病毒中和能力的变化， 为新冠病毒疫苗的改进提供了第一手信息，研究成果以第一作者和并列第一作者的身份发表于Nature, New Engl. J. Med., Cell, Nat. Med., Nat. Microbio, Nat. Commun. 等国际知名期刊。
供稿 | 刘洋课题组
编辑 | 鲍 啦
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