近日，中国科学院武汉病毒研究所龚鹏研究员受邀参加深圳湾实验室系统与物理生物学研究所系列讲座，作题为 “病毒RdRP核苷酸添加循环机制及其对核苷药物干预的启示”的学术报告。报告由系统与物理生物学研究所特聘研究员吴超主持。

在本期精彩讲座中，龚鹏介绍了本人及其团队在解析病毒RdRP核苷酸添加循环机制方面的持续性工作。

首先，龚鹏介绍到RNA病毒编码的依赖RNA的RNA聚合酶 (RdRP) 是持续合成型核酸聚合酶家族中的独特类别，也是RNA病毒的必需基因和最理想的共性抗病毒靶标。目前针对RdRP活性中心的抗RNA病毒核苷药物的研发虽有多个成功案例，但远不足以应对不断新发和再发的RNA病毒，相关研究亟待开展。龚鹏介绍，核苷药物的干预类型主要有三种，链终止型（例如索非布韦），延迟干预型（例如瑞德西韦）和诱变型（例如法匹拉韦）。就此背景他提出核苷药物理性化设计的关键基础为：1. RdRP核苷酸添加循环机制；2. 三磷酸核苷药物的干预机制；3. 药物掺入后的纠错机制。

其中，龚鹏团队在RdRP核苷酸添加循环机制研究中深耕细作，通过持续研究取得了系列成果。在模板序列的指导下，聚合酶以NTP或dNTP为底物将单磷酸核苷（NMP）逐个添加到产物链上。每一次添加过程又称核苷酸添加循环，由底物结合并诱导活性中心关闭、磷酰基转移反应以及聚合酶向模板下游转位等步骤构成，其分子机制是聚合酶领域的核心研究内容。

龚鹏在从事博士后研究期间建立了一种高效制备和结晶病毒RdRP延伸复合物的方法，主要通过生物大分子单晶X-射线衍射方法观测到了酶和底物诱导契合的过程，即核苷酸添加循环中磷酰基转移反应前的起点与终点态。研究发现其构象变化主要发生在聚合酶杯状右手结构的手掌区，这与其他右手结构的聚合酶相关构象变化发生在手指区不同。

2011年在武汉病毒所成立研究组后，龚鹏继续致力于阐明RdRP核苷酸添加循环机制，利用时间分辨晶体学和降低反应速率等方法得到中间态RdRP结构，进一步揭示了活性中心关闭由两个步骤构成，其中第一步构象变化由NTP核糖2’位羟基诱导，从而阐明了2’位修饰的核苷类分子（如丙型肝炎特效药索非布韦）可特异性抑制RNA病毒的结构基础。

之后，为充分揭示RdRP转位机制和完整绘制RdRP核苷酸添加循环图，该研究团队充分结合晶体学与酶学方法开展研究，通过改变肠道病毒RdRP-RNA复合物晶体浸泡实验中的底物NTP和副产物焦磷酸的浓度，同时结合晶体浸泡时间扫描策略并在多种复合物晶型中进行尝试，获得了正向转位和逆向转位的中间体结构。在这两类中间体结构中，RNA产物链均先于模板链发生移动，进一步提示了病毒RdRP独有的基序G的“锁定”作用对转位过程的控制。与正向转位中RNA双链始终维持原有的碱基对相互作用不同，逆向转位中间体提示RNA双链间可发生“滑动”，导致原有碱基对相互作用被打破，重新建立了亚稳定的不完全配对的双链。这一结果一定程度上提示了聚合酶催化的逆向反应比正向反应更难发生，同时也为理解聚合酶的纠错功能提供了重要依据。

为了观测到转位末期基序G“锁定”作用如何打破，从而允许模板链发生移动，研究团队系统性分析了基序G参与锁定的两个关键氨基酸位点（对应肠道病毒71型RdRP的114和115位），发现大多数RdRP在这两个位点均使用四种小侧链氨基酸（G：甘氨酸；A：丙氨酸；S：丝氨酸；T：苏氨酸），推测上述“锁定”作用很可能由空间位阻实现控制。在测试了这两个位点的G/A/S/T四种氨基酸的全部16种组合后，发现多数突变体RdRP仍然可以维持催化功能，但催化效率比之野生型发生不同程度的变化，提示突变可能对“锁定”作用产生调节。研究团队通过进一步尝试突变体RdRP-RNA复合物结构解析，利用一种kcat和野生型相当，但KM,NTP五十倍于野生型（即NTP亲和力远低于野生型）的突变体成功获得了模板链“解锁”的转位后期中间体结构。

至此，龚鹏研究组系统性阐释了RdRP核苷酸添加循环中化学反应前的活性中心关闭和化学反应后的转位这两个重要构象变化的精细过程，相对完整地绘制了循环图。

研究为进一步研究RdRP错配、基因组复制纠错和研制针对RNA病毒的核苷类高效和特效药物奠定了重要基础。龚鹏认为这对核苷药物的研发具有一定的启示：例如2’位修饰的核苷药物可能立即终止RdRP合成，但掺入活性可能会受影响；1’或4’位修饰可能导致延迟干预（药物分子随产物链转位并在新的位点发生干预），并且掺入活性可维持在较高水平。

研究团队希望能够合作开展针对RNA病毒核苷药物的创新研究：1. 系统性建立典型RdRP酶学与结构表征体系（含合成与纠错）；2. 在不同RdRP体系中开展三磷酸核苷干预机制的比较研究；3. 形成针对RNA病毒的核苷药物库并明确其干预谱，用于应对已知和未来可能出现的RNA病毒。

报告人简介：

龚鹏，中国科学院武汉病毒研究所研究员、学术委员会副主任、副所长，兼《中国病毒学》编委。1998年及2001年于清华大学化学系获得学士及硕士学位，2006年于美国University of Massachusetts Amherst化学系获博士学位。2007年至2011年于科罗拉多州立大学从事博士后研究。目前主持国家重点研发计划项目和NSFC联合基金重点项目各1项。在国际学术期刊Cell、PNAS、Nature Communications、Nucleic Acids Research、Cell Reports、PLoS Pathogens、Journal of Virology、JBC 上发表代表性通讯/一作论文19篇。曾入选国家科技创新领军人才，曾获中国科学院朱李月华优秀教师奖和中国科学院大学BHPB导师科研奖等。

主要以病毒编码的依赖RNA的RNA聚合酶 (RdRP) 为研究对象，长期从事RNA病毒转录复制与核苷药物干预研究。历时十余年解析了RdRP催化核心事件“核苷酸添加循环”的完整机制;发现RdRP引发元件可通过变构在延伸阶段发挥新功能，巧妙完成从慢速引发到快速延伸的“换挡”，破解了1999年引发元件发现以来的领域难题，2020年与饶子和院士/王权教授团队合作解析了首个新冠病毒RdRP经历多轮催化的三维结构，且从结构和酶学两个层次揭示了核苷药物瑞德西韦独特“延迟干预”机制。

撰稿 | 郑宁晨 柏玲

编辑 | 鲍 啦

责编 | 远 山

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