葛韵

深圳湾实验室 特聘研究员

首先感谢贺思敏老师的邀请和陈鹏老师的推荐。在落笔准备写下自己过往科研经历的时候，又有些许的忐忑，因为我的博士和博后生涯可谓“平常”，没有神来之笔，也少有戏剧化的发现，但若是没有一直以来的坚持和韧性，或许走不到现在。仔细想来，过去的研究经历还是有一些值得回味和交流之处，希望能够和大家分享。

先介绍一下我自己，我叫葛韵，2013年本科毕业于厦门大学化学系，之后保送至北京大学化学与分子工程学院，在化学生物学系陈鹏教授课题组进行科研学习。2018年获得化学生物学博士学位，同年赴美加入哈佛大学化学与化学生物学系Christina Woo课题组开展博士后研究，集中于O-GlcNAc糖基化修饰的相关研究。今年初回国加入深圳湾实验室化学生物学研究所开展独立研究。

顺利入门

选择加入陈鹏老师课题组得益于大三时选修了一门“化学生物学导论”的课程。课上老师提到Scripps研究所的大牛Peter Schultz教授，作为化学生物学领域的代表人物之一，实现了用新的密码子编码非天然的氨基酸。这是我第一次了解“遗传密码子拓展技术”，大为震撼的同时听到了接下来一句关键信息：“他有位学生，前几年刚回国，在北大开展这个方向。” 于是我火速地联系了陈鹏老师，陈老师也非常热心地多次和我讨论，在北大夏令营的时候还带我参观了实验室，介绍我认识了实验室的师兄师姐。后来我顺利保送北大化院，加入陈老师课题组。

今年的诺贝尔化学奖颁发给了“点击化学和生物正交反应”，掀起了一波不小的热度。我在2013年刚进入北大时，生物正交反应就可谓“如日中天”，频繁地出现在我们的课程、课题、组会上。课题组那时已有若干篇出色的工作，利用遗传密码子拓展技术，结合生物正交反应实现蛋白质选择性标记和捕获相互作用蛋白等。而在后来成为课题组特色之一的“生物正交剪切反应”，那时才刚刚萌芽。小分子抑制剂的使用是常见的蛋白质活性TURN-OFF的策略，而TURN-ON蛋白质活性却一直颇具挑战。脱保护反应已经是有机化学中普遍的一类化学反应，如果能对蛋白质进行脱保护从而重启蛋白质活性，我们就可以进一步挖掘蛋白质功能意义，精准调控细胞内生理活动。在我进组的时候，课题组已经成功地实现活细胞内光催化（JACS，2013）和钯催化（Nat. Chem.，2014）的脱笼反应激活蛋白质，同时反式环辛烯（TCO）和四嗪分子间IEDDA反应介导的脱笼反应也在开发过程中（Nat. Chem. Biol.，2014），并建立了一个高效的萤火虫荧光素酶fLuc验证体系：当在其ATP结合口袋K529位点插入非天然氨基酸时，fLuc处于失活状态不能催化底物发光，但当对非天然氨基酸脱保护使其恢复成天然赖氨酸时，fLuc又能被激活从而催化发光。这些早期的成果和基础，给当时还是科研小白的我提供了坚实的课题框架和成熟的拓展方向，也把我送上了数据产出的快车道。通过阅读文献，我们偶然发现之前作为保护基团的TCO也可以作为脱笼小分子与苯基叠氮分子发生1，3-偶极环加成反应，加成产物非常不稳定导致重排和化学断键，非常合适作为一对新的生物正交脱笼反应对。为了将其引入到蛋白质上，我和合作者樊新元博士设计了苯基叠氮基团位于赖氨酸侧链的新型非天然氨基酸PABK，基于实验室成熟的非天然氨基酸插入和蛋白质激活体系，我俩通力合作，分别完成化学合成和生物表征两方面，在几个月内便完成了主要数据的采集，想要尽快投稿。陈老师当时虽然同意了先尝试投稿，但是也给了我们预警：“课题思路相对单一，并没有挖出深度和新意。”果然粗糙第一版很快遭到了拒稿。课题组当时在新型生物正交反应的开发和应用上都有多个课题在开展，新反应和新应用不断冒出来，也给我们带来了不小的压力，重新思考这一新反应和新的非天然氨基酸还有哪些宝藏能力是我们还没有挖掘到位的。经过多次讨论，我们决定从化学和生物双管齐下对这个课题进行丰富和完善：一方面优化脱笼反应，设计多种反式环辛烯醇衍生物，从化学角度对剪切反应给出使用参考；另一方面PABK包含的苯基叠氮基团具有多样的化学反应性，本身就可以开拓出更多的蛋白质化学，包括相互作用蛋白组的光交联和目标蛋白选择性标记。这些努力使得整个文章从化学到生物都丰富了许多，最后于2016年在Chemical Science上发表。其实在投稿过程中也遇到一些波折，在我们工作审稿的同时，另一课题组在Nat. Chem.上发表了类似结构的OABK借助施陶丁格还原反应实现蛋白质激活。这使我意识到，科研是一项颇具竞争性的事业，既要做得好，又要做得快，还需要点运气加成，可能才能收获一篇“大”文章；但是除去不可控因素，自己可以做的就是坚持努力丰富手中的科研故事，将一篇工作做踏实。同年，陈鹏教授在Nat. Chem. Biol.的综述上提出了“生物正交剪切反应”的概念，系统性介绍了多样的脱笼化学及其在化学生物学中的应用。我通过这个课题参与了“生物正交剪切反应”这一课题组代表性方向的发展，涉猎了利用非天然氨基酸的插入实现蛋白质选择性标记、光交联相互作用蛋白和蛋白质激活这三个最为经典生物正交反应的应用，经过完整训练过程快速入门了“化学生物学”这一专业。

低位震荡

研三时发表第一篇文章，既让当时的我稍稍松了口气，也自觉实验“手艺”不错可以去挑战一些“大”课题了，但是没想到却是一段flop期的开始。那段时间自己做过和参与了包括蛋白质降解、分泌蛋白的激活、激酶相互作用蛋白组鉴定等不少课题，却因为自己当时知识储备和解决问题的能力不足使得课题经常停滞不前，被迫在休息室坐着冷板凳干两件事：一是花时间系统地阅读了一些方向上的文献，拓展知识面，二是受益于课题组内良好的讨论氛围，大到课题方向，小到具体实验抓住同学一起讨论推敲。也因为课题做得“杂”，自己几乎把实验室当时所有的方向都实践了一遍，还得益于化生系各个课题组之间学习交流的便利，去王初老师课题组系统地学习了定量蛋白质组学相关技术。如果说第一篇工作是自己从学习到入门的阶段，这一阶段就是我的低位震荡期，从科研到身心看起来都没啥起色。科研上的挫折难免让自己开始自我怀疑，第一篇文章是不是只是因为站在了前人的肩膀上，是不是不太适合搞学术，导致做实验的冲劲也慢慢减小。那时候经常拉着课题组的师兄师姐聊人生，感谢他们那时毫无保留地帮我分析问题，并从他们的经验出发，客观理性的分析在读博不同阶段的心境和如何做出选择。陈老师那时也鼓励我回头完成研一时没做的“功课”：先按照自己的兴趣去开拓新课题，并引导我对每个课题走向正确的思考方向。因为这么一段沉淀和积累的时间，无论从科研的悟性、实验的技巧和心态的准备上都有了潜移默化的提高。思路和知识面打开之后，也逐渐发现对蛋白质进行“加工改造”就像DIY乐高积木一样有趣，剪切、拼接、嵌合就可以造出新功能的蛋白元件。而如今回头看，再往后课题的顺利开展也部分得益于此“厚积”的阶段。

快速成长

在博士后期，因为对酶工程改造的兴趣，我的研究方向转到对转肽酶Sortase A的改造和应用上。SrtA识别C端LPXTG和N端多于3个的寡聚甘氨酸，继而催化其偶联。我们希望进一步升级这个酶，一方面提高它的催化连接效率，另一方面扩大催化底物范围，从需要至少3个寡聚甘氨酸变成一个N端甘氨酸即可。我的合作者陈龙博士通过建库和筛选，得到可识别N端单个甘氨酸的高活性SrtA突变体，我们称之为mgSrtA。基于此我们最初希望结合豆蔻酰化转移酶抑制剂的使用和定量蛋白质组学，通过SrtA标记N端裸露甘氨酸的蛋白，鉴定豆蔻酰化底物。通过多次方法优化，我们能够鉴定到32种豆蔻酰化转移酶的底物并做了相关验证。虽然蛋白脂酰化修饰领域专家Edward Tate组后来在2019年初的MCP上报道了一模一样的标记方法，鉴定到40个底物蛋白，但是在2018年初的我们始终纠结于鉴定蛋白数目难以提高的问题，使得这一应用进入了一种“食之无味、弃之可惜”的阶段。

然而2018年初一篇研究T细胞和DC细胞相互作用的Nature文章横空出世，将SrtA和寡聚甘氨酸基团分别与诱导细胞间相互作用的CD40-CD40L融合展示在细胞表面，借助SrtA催化的标记效率反映CD40-CD40L介导的细胞间互作情况。我们立刻意识到这也是一种“邻近标记”的概念，如果细胞表面本身就有很多含N端甘氨酸的蛋白，我们进化得到的mgSrtA则可以无需在互作细胞上引入寡聚甘氨酸就能实现细胞表面标记。通过查阅文献很快发现细胞表面确实有一些N端含有甘氨酸的蛋白，且主要以仅含单个甘氨酸的蛋白为主，这使得mgSrtA恰好能够弥补野生型SrtA活性和底物范围上的局限性。因此，我们在2018年春节过后迅速开展一系列新实验去验证mgSrtA在细胞表面标记上的能力。相比于野生型的SrtA，mgSrtA能够更加有效地将多肽探针、荧光蛋白等修饰在细胞表面。进一步将mgSrtA展示在“诱饵”细胞表面，通过构建了两类细胞间相互作用体系去验证其标记“猎物”细胞的能力：一类是展示Her2亲合体ZHER的细胞和Her2高表达的乳腺癌细胞间的互作；另一类是免疫受体-配体相互作用介导的细胞互作。幸运的是，mgSrtA都可以在细胞互作时有效标记“猎物”细胞，因此该方法被命名为“酶介导的邻近细胞标记技术”（enzyme-mediated proximity cell labeling，EXCELL）。同时期有多篇蛋白质邻近标记新技术的文章发表，其中也有用于细胞间标记的展示，但是无一例外需要对“诱饵”和“猎物”细胞同时进行基因改造，而我们的方法无需预知相互作用细胞类型，不仅易于监测，在未来还可以与流式分选、基因测序等多种下游分析平台兼容，完成对相互作用细胞组的捕获、富集和鉴定，从而进一步得出细胞间相互作用在时间、空间、细胞类型等多方面的信息。我们文章发表之后被Chemical & Engineering News专题报道，也被众多高水平杂志引用，洛克菲勒大学的免疫学家Gabriel D. Victora评价该工具：“This may provide additional flexibility to the system by not requiring engineering of an acceptor mouse strain”，更预示了该工作在活体动物上的巨大应用前景。我在完成这篇工作后就赴美开始博后工作，而陈老师课题组则围绕着“细胞互作”这一主题从邻近化学和生物学问题两方面继续开展了更为深入的探索，近两年也陆续有漂亮的工作发表。

带着博士期间积累的知识技能和信心，我在2018年10月来到哈佛大学Christina Woo课题组开展博后的研究，加入了戏称为“The sweetest subgroup” 的GlycoTeam，研究胞内蛋白丝氨酸或苏氨酸上的O-GlcNAc修饰。一进组就直指领域内一个长期的挑战：实现蛋白质选择性的O-GlcNAc修饰调控。我一想，这不也是一个“邻近化学”的问题么？解题思路似乎很简单，将O-GlcNAc唯一的水解酶OGA招募到特定底物附近，让酶促反应“强制”发生，就可以实现蛋白选择性去糖基化了。但是如何将酶和底物选择性拉到一起呢？非抑制剂型小分子配体的缺乏使得设计类似“PROTAC”的嵌合小分子几乎不可行。合作者Daniel Ramirez就想利用可以在胞内融合表达的纳米抗体（nanobody）实现目标蛋白靶向。那么以nanobody作为弹头，直接装载着OGA酶，是不是就可以实现靶向去糖基化了呢？答案：是，也不是。最大的问题就是OGA活性很高，和nanobody融合表达在胞内的时候就已经可以无差别地对很多底物蛋白去糖基化了，无法体现“选择性”。若要实现邻近效应带来的选择性，就需要将OGA水解酶活性降低，仅当聚集在底物附近时才足以催化糖基水解。博士期间积累的蛋白质改造的基础使我开始着手拆解OGA这个酶。先尝试了不同的截短体，但是均难以将OGA酶活性调整到合适的范围。2019年4月，著名化学生物学家Alice Ting来到哈佛CCB做报告。在她的工作中多次出现的Split-APEX等split enzyme的设计击中了我，让我想起之前文献中已经报道OGA会在细胞凋亡过程中被切开成两部分，且两部分仍然能够相互结合保留水解酶活性，这不就是一个天然的split 位点么？于是我迅速地设计split OGA，在此基础上再尝试不同的截短体，最终优化出一个活性极低的split OGA变体，仅有在通过nanobody靶向至底物附近时，才足以对目标蛋白去糖基化，实现高选择性。后续的优化、表征实验就开展得非常顺利。赶在哈佛2020年3月中旬因为疫情关门之前我拿到了基本的数据，在居家期间完成投稿。自2020年因疫情停摆之后，Harvard-MIT-Broad研究所也开始定期组织线上的超级大组会，邀请来自不同课题组、不同方向的研究者分享自己的科研成果，我也有幸在文章返修阶段分享了自己的工作，并收到很多有益的建议，对文章后期提升帮助很大。哈佛6月份校园重开后，我很快收到了审稿意见开始补数据，最终在2020年12月22日收到了文章被Nat. Chem. Biol.接受的好消息，可以说是最好的圣诞节礼物。我所设计的Nanobody-splitOGA和同课题组发表的Nanobody-OGT共同组成一对胞内O-GlcNAc糖基化修饰的蛋白靶向编辑器，助力O-GlcNAc在特定蛋白上的功能解析。这一工作获得了国内外媒体的广泛关注，Woo课题组后续也利用这套工具，应用于激酶上糖基化修饰的研究。Broad研究所的Choudhary教授在综述中也将这套工具归类于“bifunctional modalities”，可以想见，nanobody-OGT/OGA这套化学生物学工具的设计思路和模式，可以拓展到更多其他的蛋白质翻译后修饰上，开发出特定的靶向调控工具。

        回想起来，博士期间在知识、思维和技术储备上的“厚积”，才造就了博后工作时的“薄发”。毕业的时候也和陈老师提过，感觉自己直到做邻近标记课题的时候才对科研开了窍，懂得如何梳理课题逻辑，挖掘工作的特色和亮点。陈老师课题组始终延续的高要求和高标准也一直敲打着自己不能放松懈怠。而O-GlcNAc糖基化研究相关内容和背景，在北大读博期间从隔壁陈兴教授课题组的工作和化学生物学专业课程上积累了一些，糖基化蛋白组学实验也得益于博士期间去王初教授课题组学习定量蛋白组学技术打下的基础。北大化生系的很多同学们在毕业后也一直保持着联系，经常相互讨论和分享学术。陈老师和CP family的很多成员在我博士阶段的科研、博后和教职申请等学术道路关键时期都毫无保留地给予了各个方面的帮助，每当遇到疑惑和困难的时候，总有这些“过来人”可以请教也更让我有了坚持下去的勇气。若是没有陈鹏课题组和北大化学生物学系这样的氛围，我想我个人学术道路的选择和发展未必会这样顺利。这让我也希望将这样互帮互助的文化传递给我的师弟师妹们以及我课题组的成员，每一步的用心积累和偶尔的无心插柳，都会让未来的道路越走越清晰，越走越坚定。

北大&哈佛期间的学习与生活

就像我每一次都选择了年轻的课题组一样，这次我也选择来到位于学术新地深圳的新机构——深圳湾实验室，于今年2月份正式加入化学生物学研究所担任独立PI，组建自己的课题组。深圳是一个“敢闯敢试、敢为人先”的地方，而深圳湾实验室提供了非常好的科研和转化平台。就好像当年下海深圳闯特区的人们一样，我在这里也有一种自主创业、孵化团队的感觉。转变身份后，再次复盘自己过去的博士经历，虽然一路上有各方面的困难，但是只要敢想、肯干，收获的时刻也只是早晚而已。深圳地铁也有过出圈的标语，“不躺平”、“不内卷”，我想做科研也是一样，在疫情暴发、计划永远赶不上变化的当下，在良好的科研平台上，努力追求高质量的科研目标，同时享受探索未知带来的乐趣，已经是非常幸福的事情了。

团队与实验室@SZBL

最后也希望借此打个广告，我课题组聚焦糖化学生物学、细胞表面化学和纳米抗体的工程改造，欢迎优秀人才应聘博士后、联合培养研究生和科研助理等岗位，深圳湾实验室也提供先进的科研平台和生活支持，详情请见招聘广告，非常欢迎大家的转发和推荐！

编辑 | 鲍 啦

欢迎投稿、建议 | media@szbl.ac.cn