把一个基因切成两段，分别翻译成两段蛋白片段，还会有原来的功能吗？实验发现，大多数蛋白片段会失去功能，少数可以自动组合继续维持原有功能，还有的需要其他辅助措施（例如距离的约束）才能维持原有功能。前者被称为自我互补片段(self-complementary fragment)，后者被称为辅助互补或者有条件互补片段（assisted or conditional complementary fragments）。辅助互补片段是探测生物分子间相互作用的重要工具。然而，找到合适的切割点、发现信噪比高的辅助互补片段极其费时耗力，成功率低，目前仅发现不到20个辅助互补变体。深圳湾实验室的詹剑研究员和周耀旗教授在格里菲斯大学时与周凯博士（第一作者）、Thomas Litfin博士（共同第一作者）、Solayman博士生(共同第一作者)以及赵惠军教授合作，成功地发展了一个高通量HiTS（High-Throughput Split-protein profiling)技术，能够快速发现自我互补和辅助互补片段。该项研究发表在International Journal of Biological Macromolecules 203,543-552(2022)上。
蛋白质在其化学键断裂后形成的碎片可以自发地结合，或在其他分子的帮助下结合。这些自我和辅助的互补片段在生物技术上有许多应用。例如，荧光蛋白的自我互补的两个片段，其中一个可以用来标记目标蛋白，当这个片段与它的自我互补片段结合时就会发出荧光，通过荧光检测，就能探测目标蛋白的细胞定位、聚集和细胞凋亡的时空动态；而辅助互补片段只有在两个有相互作用的分子拉近距离时才能结合，从而可以用于定量检测辅助分子间的相互作用是否存在，这种技术被称为蛋白质片段互补分析 (Protein Complementary Assay, PCA),或者裂解蛋白生物传感器（Split-protein biosensors），用于探测各种生命系统中的瞬时和不可逆的蛋白-蛋白相互作用。
自我互补片段比较容易找到，如果一个蛋白质有两个相对独立、稳定的结构区，它们分开后能够重新结合成原来结构的可能性就比较大，从而能够实现原来的功能。但辅助互补片段就难找到，它们只有在辅助分子把互补片段限制在近距离时，才能互相结合而实现原来的功能，也就是说，它们之间的结合焓很弱，只有在结合熵小的时候才能有足够强的结合自由能使它们结合起来，形成未切割前的结构和功能。
通常，辅助互补片段的发现需要先找到自我互补片段，然后通过突变降低它们之间的结合焓，使得自我互补变成辅助互补。还有一个办法是进行不同位置的试错，直到发现正确的辅助互补片段为止。这个方法非常耗时费力，而且无法保证信噪比高。因此到目前为止仅发现了不到20个蛋白的辅助互补片段。但是不同的生物体系需要不同的方法来探测蛋白-蛋白相互作用，同时信噪比有待进一步的提高，所以开发一个快速发现辅助互补系统的技术有着重要的意义。
该论文设计了HiTS (High-Throughput Split-protein profiling)技术，利用转座酶将转座子随机插入含有报告蛋白基因中，然后转座子被可以调控的蛋白质-蛋白质相互作用对所替换。下一步是在非诱导和诱导条件下生成三个文库（无筛选，自我，辅助,见图）。这些文库将根据报告基因的功能进行选择，例如用于荧光的流式细胞仪或用于酶的酶活性。最后选定的样本将进行高通量测序，并将采用 HiTS 数据分析流程来分析每个分拆位点的自补和辅助互补的可能性。
为了证明该技术，该论文利用三个抗菌抗性基因（磷霉素抗性基因 fosA3、红霉素抗性基因 ermB 和氯霉素抗性基因 catI）分别作为报告蛋白，以及雷帕霉素控制的FRB-FKBP蛋白-蛋白相互作用对来生成三个待测序文库：无筛选（无针对性抗菌素）、自我互补（加针对该抗菌抗性基因的抗菌素）和辅助互补（加针对性抗菌素和雷帕霉素）。如果切割后产生自我互补片段，切割变体将在有针对该抗菌抗性基因的抗菌素的情况下生存并扩增，测序列将发现自我互补库里数量远超过无筛选库。如果切割后产生辅助互补片段，切割变体仅仅能在雷帕霉素和针对该抗菌抗性基因的抗菌素同时存在的情况下生存并扩增，因为雷帕霉素导致FRB与FKBP结合，从而把与它们分别连接的两个抗菌抗性蛋白片段约束在一定距离内而促成辅助互补片段的结合，测序列将发现辅助互补库里的数量将远超过自我互补库。
HiTS实验在磷霉素抗性基因中发现了多个有统计意义的自我和辅助互补切割位置，在红霉素抗性基因中发现了两个辅助互补切割位置，但在氯霉素抗性基因中没有发现自我或辅助互补片段。这些互补体系都通过低通量实验得到了进一步证实。实验表明，不同的蛋白由于结构的不同会对切割有不同的反应。值得一提的是，新发现的磷霉素抗性基因辅助互补片段达到了最理想的信噪比：有相互作用的蛋白对细菌生长良好，而无相互作用的蛋白对细菌不能生存，这些辅助互补片段将成为探测蛋白-蛋白相互作用的新工具。而HiTS技术的测试成功为该方法在其它报告基因的应用上打下了基础。
周耀旗教授从2021年3月起全职加入了深圳湾实验室，他是1984年中国科技大学近代化学系的学士，1990年美国纽约州立石溪大学化学物理的博士，1994-2000年北卡州立大学、哈佛大学的博士后，2000年任纽约州立布法罗大学助理教授，2004年升为终身副教授，2006年成为印第安纳大学信息学院和医学院终身正教授，2013-2021年任澳大利亚格里菲斯大学糖组学研究所正教授。他长期在结构生物信息学方面工作，曾经多次在国际蛋白质结构预测和功能预测比赛中名列前茅。到目前为止共发表论文200余篇，引用1万多次，H因子63。目前，周耀旗课题组通过计算和实验的结合，从事蛋白质/RNA的序列、结构与功能关系方面的基础研究和生物分子检测、药物开发方面的应用研究。寻找在RNA/蛋白方面有AI计算和分子及细胞生物学实验相关经验的博士后和助理研究员。
原文信息：
供稿 | 周耀旗课题组
编辑 | 鲍 啦
