2024年6月4日，深圳湾实验室系统与物理生物学研究所李刚课题组在Nature Chemistry期刊发表了题为“Global profiling of functional histidines in live cells using small molecule photosensitizer and chemical probe relay labeling”的研究论文。该论文利用光敏小分子产生单线态氧，首次在活细胞中实现了组氨酸的高特异性、高覆盖度的组学标记，发掘了金属蛋白中的关键组氨酸位点以及介导蛋白互作的功能性组氨酸。
基于化学标记的功能蛋白质组学，将蛋白质组的分析精度从蛋白质水平提高到氨基酸位点水平，从而解析蛋白质功能的关键氨基酸位点，以及为特定氨基酸位点发现共价抑制剂。经过近二十年的发展，尽管已经实现了亲核性较强氨基酸（如半胱氨酸、赖氨酸等）的标记，但是对于亲核性较弱的氨基酸，如组氨酸、精氨酸、丝氨酸/苏氨酸等，目前在细胞内缺乏较好的标记方法。作者设想解决思路在于发展有别于传统的亲核取代反应的策略，例如利用这些氨基酸的氧化还原电势的差异实现选择性标记等。
其中，组氨酸通常存在于蛋白酶活性位点、金属结合位点和蛋白质-蛋白质相互作用界面。然而组氨酸位点标记被探索的比较少。目前组氨酸位点的标记方法较少，且现有方法均无法实现在细胞内对组氨酸进行全蛋白质组的标记。在课题组此前发表的基于单线态氧的邻近标记工作中（Zhai and Li, Nat. Commun. 2022），利用蛋白质组学质谱方法对化学修饰机理的表征，作者发现利用单线态氧与苯胺探针标记联合，可以特异性修饰组氨酸。作者设想利用小分子光敏剂与化学探针接力反应的策略实现组氨酸标记（图1A），小分子光敏剂具有更高的单线态氧产生效率，并且可以进入细胞，从而实现对活细胞或者组织的原位分析。作者首先筛选了17种光敏剂小分子以及25种不同的化学探针，确定了最优的组合。利用蛋白质组学质谱技术对标记位点进行分析，作者发现组氨酸的标记特异性在98%以上，同时多个光敏剂可以鉴定超过3000个组氨酸位点，共鉴定约2400个蛋白中的7200个位点（图1B），是目前唯一可以实现组氨酸活细胞标记的方法。由于不同研究小组提出了不同的单线态氧氧化组氨酸的反应机理，作者利用乙酰组氨作为底物模拟物，通过核磁谱图以及X射线单晶衍射鉴定了精确的产物结构，为关于单线态氧氧化组氨酸的机理争论画上了句号（图1C）。
图1：活细胞内组氨酸全局标记方法。A）基于光敏分子以及化学探针标记方法的流程图；B）利用化学蛋白质组学技术分析组氨酸的标记特异性，以及蛋白质组覆盖深度；C）利用X射线单晶衍射鉴定了精确的产物结构，及相关的单线态氧氧化的化学机理。
接下来，作者利用这一标记方法做了两方面的生物学探索。首先，尝试利用此标记方法发现新的与金属配位的组氨酸功能位点。作者假设当组氨酸与金属配位后，将会降低其电子密度，从而不容易被单线态氧氧化，这一假设通过模型蛋白得到确认后，作者利用EDTA处理蛋白质组，并利用SILAC（稳定同位素标记）蛋白质组比较EDTA处理前后标记组氨酸的变化，共鉴定到了44个EDTA敏感的组氨酸位点（图2A）。通过进一步的生物化学验证，作者鉴定到了蛋白酶IDH1的关键组氨酸位点H309突变后完全丧失蛋白活性（图2B），以及结构蛋白CRIP1中未被报道的与锌离子结合的组氨酸位点H37（图2C），证明了作者的方法可以用来鉴定未知的金属蛋白的功能组氨酸位点。
其次，生物信息学分析表明，作者的方法标记的组氨酸位点大多位于蛋白质表面，因此作者假设蛋白-蛋白互作会影响处于蛋白-蛋白相互作用界面的组氨酸标记。通过6xHis标签蛋白与6xHis抗体结合验证了这一假设后，作者利用线粒体自噬模型，鉴定了标记减弱的组氨酸位点，预示着可能有新的蛋白质互作在此过程中发生（图2D）。最后，作者聚焦到一个和线粒体自噬高度相关的蛋白Park7的H138位点的标记变化，利用蛋白质组学鉴定了其在线粒体自噬过程中增加的互作蛋白，并进行了逐一敲低，发现其中一个蛋白LUC7L3敲低后，标记条带发生了回补（图2E），证明了此蛋白与Park7互作影响了H138的标记，也证明了作者的标记方法可以应用于发现介导蛋白-蛋白相互作用的关键组氨酸位点。为了探索H138位点对蛋白功能的影响，作者将其突变成丙氨酸, 通过免疫共沉淀-质谱方法比较突变前后互作蛋白的差异，发现H138A突变后，与线粒体定位的分子伴侣蛋白的相互作用增加，进一步通过提取线粒体组分实验，证明Park7突变之后增加了线粒体定位（图2F）。
图2：利用组氨酸标记进行的未知生物学探索。A）利用EDTA处理前后，标记变化的组氨酸位点；B）IDH1蛋白H309位点的发现与功能研究；C）CRIP1 蛋白H37位点的发现与功能研究；D）利用线粒体自噬模型过程中由组氨酸介导的新型蛋白蛋白相互作用；E）LUC7L3与Park7蛋白互作，影响了Park7蛋白H138位点的标记；F）Park7 的H138位点突变后，增加了其在线粒体上的定位。
综上所述，作者通过小分子光敏剂库和化学探针库筛选，实现了活细胞中特异的组氨酸位点标记；并深入覆盖整个蛋白质组。作者进一步利用核磁共振光谱和 X 射线晶体学，阐明反应机制和和解析结构；在生物学方面，作者发现了与酶活性和金属结合相关的并且未注释的组氨酸位点；发现组氨酸位点在线粒体自噬过程中的可及性变化和对蛋白亚细胞定位的影响。
李刚研究员为该论文的唯一通讯作者，课题组的研究助理（现为联培博士生）翟彦生为该论文的第一作者。该工作得到了北京大学王初课题组，大连理工大学孙文课题组，深圳大学王东课题组，以及深圳湾实验室蔡羽轩课题组的帮助；北京大学罗佗平课题组在反应机理研究中给予了重大帮助，一并致谢。该工作主要由深圳湾实验室相关经费支持完成。
李刚课题组（http://chemoproteomics-lab.szbl.ac.cn/）目前的研究方向包括：1）开发邻近标记、化学交联质谱等蛋白质组学平台，进行蛋白蛋白相互作用研究，鉴定泛素连接酶以及去泛素化酶的作用底物，探索肿瘤治疗的泛素化修饰蛋白新靶点。2）开发功能氨基酸的全蛋白质组修饰方法，为无法成药蛋白寻找新的共价配体，并利用配体研究RNA结合蛋白的功能。3）开发“分子库-对-分子库”筛选平台，以超高通量快速筛选蛋白酶的抑制剂分子，以及靶向功能氨基酸的共价配体。课题组常年招聘博士后、联培博士研究生加入，共同探究功能蛋白质组学的研究前沿，请有意者发送简历到ligang@szbl.ac.cn 。
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延伸阅读：
李刚课题组报道基于单线态氧的高时空分辨率邻近标记蛋白质组学分析方法
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