蛋白质的四级结构对于调控蛋白质的生物功能具有重要作用。非变性质谱技术由于能够在气相中保持蛋白质复合物的完整性，已成为解读蛋白质四级结构的有力工具。在串级质谱测定中，利用碰撞诱导解离（CID）反应可以使蛋白亚基从复合物中解离，从而提供关于蛋白结合计量关系和拓扑学的结构信息。既往研究表明外周亚基倾向于在CID反应中解离。这样的解离行为有助于依据规律分析复合物架构，但也限制了得以解离的亚基种类，不利于分析由多种亚基构成且结构未知的复杂化合物。
深圳湾实验室细胞分析研究所与南京师范大学、清华大学、北京大学、荷兰Genmab公司、荷兰乌特勒支大学共同开展的研究表明，在较高的碰撞能量下进行的CID反应中，蛋白质复合物能够以较高的倾向性解离内部亚基，且解离路径可通过调节反应条件定向进行。相关研究发表于《分析化学》（Analytical Chemistry）期刊。
该研究结果表明对于蛋白质复合物内部亚基的解离可通过直接和间接两种方式实现。在间接途径中，利用高能量的连续CID反应，可在解离外周亚基后以较高的几率随即解离内部亚基。
图1. 20S复合物（28个亚基，分子量近700 kDa）在较高能量CID反应中的多亚基连续解离。（A）不同碰撞能量下的串级质谱图。（B）亚基解离路径及相应的理论几率。实测内部亚基的解离几率远高于理论值，表明复合物气相结构在首个亚基离去后发生了改变。
在直接途径中，内部亚基可从价态降低的环状结构蛋白复合物，或具有伸展结构的复合物中直接解离。
图2. 20S复合物在价态降低条件下的CID反应。（A）多个低价态20S复合物离子的解离效果。（B）单个价态20S复合物离子的解离效果。（C）局部放大谱图，表明内部亚基的解离几率与复合物整体价态的对应关系。
图3. 环状六聚抗体-抗原复合物（由两种单抗各3个亚基及仅由其中一种单抗识别的抗原构成）的解离反应。（A）电镜表征结果。（B）复合物架构示意图。（C）解离反应的串级质谱图，表明内部抗体亚基的解离几率几乎与外部抗体亚基持平。
图4. 具有伸展结构的补体相关复合物C1r(2)C1s(2)的解离反应。（A）复合物架构示意图。（B）该复合物的非变性质谱图可用于鉴定体系中共存的多种亚复合物。（C）C1r(2)C1s(2)解离的串级质谱图，表明内部亚基的解离几率几乎与外部亚基持平。
在可控条件下定向解离内部亚基，对于获得复杂蛋白质复合物的细节结构信息，以及研究蛋白复合物在气相中的高级结构和能量演变都具有意义。其中涉及的单克隆抗体（单抗）药物-靶点抗原复合物结构和功能研究对于单抗药物的活性调控具有独到作用。该研究的主体工作由深圳湾实验室细胞分析研究所完成，其配备的超高分辨质谱仪器在研究中体现了独到的性能优势。该所黄岩谊教授、清华大学王宏伟教授和王建斌教授对相关工作给予了大力支持。
研究所简介：
细胞分析研究所以细胞分析中的科学技术的关键突破为基础，以关键基础生物学问题和人民健康重大问题为导向，现组建人才团队开展如下方向的研究工作：以新型蛋白质组学分析技术为代表的细胞分析新技术的研究；发展以微量细胞表征、操纵和处理为主的高通量自动化多组学分析技术；建设具有国际领先水平的细胞分析技术研究技术平台。研究所现有轨道阱超高分辨质谱仪、组织成像质谱仪等大型仪器设备。
论文链接：https://dx.doi.org/10.1021/acs.analchem.0c02845
供稿 | 细胞分析研究所
编辑 | 白 白、远 山
