近日，深圳湾实验室孙坤课题组与合作者在Patterns期刊（Cell新子刊）发表了题目为“Msuite: A High-Performance and Versatile DNA Methylation Data-Analysis Toolkit”的研究论文，介绍了课题组与合作者研发的全新DNA甲基化分析软件——Msuite。该软件整合了质控、序列比对、甲基化位点检测、以及丰富的数据可视化等功能（图1）。与当前市场上的同类型软件相比，Msuite软件有更高的准确性和更低的计算资源需求。同时，除了分析传统的亚硫酸盐测序数据时通用的3碱基分析（即所有的C都转化为T）模式，Msuite软件还针对近年来新发展出的bisulfite-free甲基化分析技术提供了一种独有的4碱基分析模式。故Msuite有望成为DNA甲基化分析的一款理想化软件。
图1：Msuite的工作流程与数据可视化
DNA甲基化与分析方法
DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰，与许多生物调控途径有关，DNA甲基化组也是一种常见的组学研究内容。目前虽存在多种碱基级别分辨率的甲基化定量方法，如全基因组亚硫酸盐测序（whole genome bisulfite sequencing），但DNA甲基化数据的分析仍然是一项复杂且富有挑战的工作。
传统的DNA甲基化分析方法（图2），即亚硫酸盐测序，用重亚硫酸盐把未甲基化的胞嘧啶(C)转化成尿嘧啶(U)，而经过甲基化修饰的胞嘧啶(C)并不受影响，仍然保持(C)碱基的状态。在后续的PCR反应中，U会被识别为胸腺嘧啶(T)；因此根据互补配对原则，之后的PCR产物中，未甲基化的C都变成了T而甲基化的C保持不变。在哺乳动物中，被甲基化修饰的C大部分出现在CpG二核苷酸结构（胞嘧啶C后面紧接着鸟嘌呤G）当中，该结构只占了全部C的很少一部分（人的基因组中约5%）。因此，亚硫酸处理会使得DNA中占绝大部分的未甲基化的C转变为T，从而导致GC含量大幅下降，非常影响测序的准确性。
近年来，研究人员开发出了多种新兴的甲基化分析方法。这些新方法的共同特色是：不采用亚硫酸盐处理，而是使用其他转化酶，经过一系列的化学反应，将甲基化的C转化成T，而未甲基化的C保持不变，因此可统称为bisulfite-free方法。使用bisulfite-free方法处理的DNA序列只有很小一部分C发生了改变，因此保持了较高的序列复杂性，并对上述GC偏差的问题有了很好的改善。此外，bisulfite-free方法也具有更低的DNA降解率，适用范围更广泛。
图2：DNA甲基化研究方法，左侧为实验技术，右侧为Msuite的分析流程
无论是亚硫酸盐测序还是bisulfite-free方法，都会将一部分C转化为T，转化后的DNA并不能直接比对到基因组。目前的主流分析方法都是为亚硫酸盐测序所设计，大多使用了3碱基匹配模式（把参考基因组和测序序列的C都转成T），但是该模式并没有发挥出bisulfite-free技术的序列复杂度的优势。还有一些软件采用通配符匹配法（即忽略C和T之间的错配），速度较慢，匹配率也有所欠缺。此外，当前软件的集成度较低，需要用户自己做质控和下游分析。
为了应对上述问题，孙坤课题组开发了Msuite软件,集成了质控、序列比对、甲基化位点检测和丰富的数据可视化等功能，旨在为当前大多数DNA甲基化分析提供一款全功能的软件包（图2）。Msuite包含了一种全新的4碱基匹配算法，专门为新兴的bisulfite-free方法的数据进行设计和优化。和当前的同类型工具相比，Msuite有更高的精准度、匹配率，同时对于计算资源的需求也更少。因此，Msuite有望成为DNA甲基化数据分析的理想软件，尤其可以促进新兴的bisulfite-free方法的普及。
Msuite的特色和优势
研究人员将Msuite和目前的主流软件进行了详细比较，结果表明，Msuite在功能和兼容性上均优于其他软件（表1），而且更加易于使用。同时，Msuite在比对率、准确度、运算时间和内存需求上都具有明显优势（表2）。
表1：Msuite与主流软件的功能特性比较
表2：Msuite与主流软件的性能对比
此外，Msuite提供详细的质控信息和丰富的数据可视化功能（图3）——以网页形式提供数据分析中的关键参数，供用户评估数据的质量；输出的分析结果可使用UCSC Genome Browser、IGV或者Circos等软件进行可视化；其附带的Mviewer软件可提供一种具有特色的数据可视化方案（图3C），尤其适于展示基因型相关的甲基化模式。
深圳湾实验室博士后李丽诗、研究助理马丽，中山大学赵喻教授，深圳湾实验室分子生理研究所特聘研究员邓麟，香港中文大学王华婷教授、孙昊教授共同参与完成本项研究。
图3：Msuite提供丰富的数据可视化功能
课题组介绍：
孙坤 特聘研究员
孙坤博士2014年在香港中文大学获得博士学位，并于2019年全职加入深圳湾实验室，任特聘研究员。孙坤博士长期从事生物信息学和基于外周血游离DNA的液态活检(无创产前测试和癌症诊断)方向的研究，拥有近10年的生物医学大数据分析经验，发表SCI文章40余篇，其中（共同）第一作者或通讯作者20余篇(包括Cancer Discovery、PNAS、Genome Research、EMBO Journal、Nature Communications、Briefings in Bioinformatics等)，总被引用2300余次。孙坤博士的工作注重原创性和转化价值，曾参与申请多项国际专利，其中一些已经转让给GRAIL、Illumina等多家液态活检领域内的知名公司。
孙坤博士课题组主要研究方向包括但不仅限于：(1) 生物信息学软件开发；(2) 大型数据集信息挖掘；(3) 高准确度、低成本的癌症生物标记物筛选；(4) 单细胞技术在分子诊断方向的应用探索。
健康大数据时代，生物信息学在生物医学的很多领域都扮演着重要的角色，孙坤博士课题组诚邀有志之士加入！
论文标题：Msuite: A High-Performance and Versatile DNA Methylation Data-Analysis Toolkit
论文全文：https://www.cell.com/patterns/fulltext/S2666-3899(20)30168-9
Msuite下载地址：https://github.com/hellosunking/Msuite
撰稿 | 孙坤课题组
编辑 | 白 白、远 山
