近期，深圳湾实验室传染病研究所刘洋课题组和美国德克萨斯大学医学分部（the University of Texas Medical Branch，UTMB）史佩勇课题组合作在 Signal Transduction and Targeted Therapy 发表了题为Cross-neutralization and cross-protection among SARS-CoV-2 viruses bearing different variant spikes的文章。该研究使用多个变种新冠病毒刺突蛋白的嵌合病毒免疫仓鼠动物模型，全面评估了不同变种病毒诱导动物产生抗血清的中和能力，验证了免疫后的仓鼠面对不同变种的抗病毒能力，为人群新冠疫苗后续接种策略提供参考依据。
新型冠状病毒（SARS-CoV-2）自2019年底流行至今，目前已造成6亿人次感染和超过648万人死亡，严重威胁人类健康和公共卫生安全。新冠病毒属于单链RNA病毒，缺乏足够的复制纠错手段，非常容易发生突变。在新冠病毒的流行过程中，各种变种新冠病毒层出不穷。迄今为止，有5种变种新冠病毒被WHO认定为值得关注的种类，包括Alpha毒株，2020年9月最早发现于英国；Beta毒株，2020年9月最早发现于南非；Gamma毒株，2020年11月最早发现于巴西；Delta毒株，2020年10月最早发现于印度；Omicron毒株，2021年11月，最早出现于南非。同一时间内，世界各地不同区域存在不同变种新冠病毒流行。感染过不同变种新冠病毒的人群，由于旅行等原因，会在不同地域遭遇到异种新冠病毒的攻击。解析不同变种新冠病毒感染后，对同种/异种新冠病毒感染交叉中和及保护能力的强弱，对人群疫苗接种策略的选择和新冠防控策略的制定，都有着重要的意义。
在本项研究中，研究人员使用了原始的USA-WA1/2020新冠毒株作为野生型（WT），将不同变种新冠病毒的（Spike）刺突蛋白构建到该WT病毒的骨架上[1]。刺突蛋白是新冠病毒表面最重要的抗原，也是各类抗体和抗血清的主要中和靶标。研究人员统一使用WT病毒骨架的优点在于可以避免不同变种新冠病毒非刺突蛋白区域（Non-spike region）的差异造成病毒复制和增殖能力的不同，降低其对诱导抗血清的能力的影响。前期实验结果表明，使用WT病毒骨架的不同嵌合新冠毒株在Vero E6细胞上具有近似的扩增能力；通过噬斑实验（Plaque assay）产生的噬斑大小也基本一致。这样的实验设置尽可能减少了可变因子，使得对不同变种新冠病毒刺突蛋白交叉保护能力的评估结果具有更高的可信度。
研究人员使用仓鼠作为研究抗血清中和交叉保护效果的动物模型。仓鼠在研究新冠病毒感染和传播实验中被广泛使用。新冠病毒感染仓鼠后，可以产生与人感染相近的临床症状，其肺部损伤的病理切片和人感染类似；仓鼠还具有打喷嚏的生理现象，可以很好的模拟新冠病毒感染后的飞沫传播，是研究新冠病毒的优秀动物模型。研究人员将同样106个PFU的不同嵌合病毒通过鼻腔（Intranasal，IN）接种到仓鼠动物模型上，每天观察仓鼠的体重变化，并在仓鼠被病毒接种的第14,28和45天，从仓鼠上采集血液，分离得到抗血清（图1a）。实验结果表明，仓鼠在接种不同变异毒株后体重下降趋势存在较大差别，其中感染Alpha+E484K突变的病毒造成最严重的体重下降。对不同组仓鼠的临床症状的观察结果也和体重下降的趋势非常吻合（图1b, c）。
图1 新冠变种病毒仓鼠实验流程及病毒接种后的体重变化和临床症状
随后，研究人员使用从仓鼠上获取的抗血清，检测它们对同种/异种刺突蛋白嵌合新冠病毒的交叉中和能力。为了提高检测效率，研究人员使用了整合入mNeoGreen绿色荧光蛋白的不同变种嵌合病毒，使用FFRNT（Fluorescent foci reduction neutralization test）的检测方法，通过机器自动识别被病毒感染后产生绿色荧光的细胞，来计算抗血清针对特定变种病毒的中和效率。该检测方法和经典的PRNT（Plaque reduction neutralization test）的方法相比，其检测结果相关性的R2值可以达到0.8以上，吻合度非常好，但检测效率可以提高数十倍[2]。FFRNT的检测结果表明，不同变种病毒免疫仓鼠的抗血清交叉中和的效率存在着非常大的差别。在多数病毒接种后的第14天，就可以迅速建立对同种病毒的免疫保护能力，且中和效力数值很高；而对异种病毒的中和能力的抬升速率就要慢的多，在病毒接种28天时中和能力会有显著性的提升，到45天时达到峰值。综合来说，抗血清针对同种病毒的中和能力从接种早期（14天）到后期（45天）的提升不高，最大约2.3倍；而对于异种血清的中和能力随着时间可以有超过20倍的提升。血清对同种病毒和异种病毒的中和能力之间的差异随着时间的推移会逐渐减少，在第14、28和45天的最大差距分别是62倍，15倍，9.7倍（图2）。这个结果表明，当被新冠病毒感染后，在2周左右就能对同种病毒的再次感染有着较强的保护，而需要1-2个月时间才能建立针对异种病毒稳定高效的保护。比较特别的是，被Alpha+E484K嵌合病毒感染的仓鼠在早期（14天）就具有相当高效的中和能力，随着时间推移并没有发生明显的增强。在之前的实验中，观察到了该嵌合病毒感染仓鼠后，仓鼠的体重下降和临床症状最为严重，可能是由于更加烈性的感染使得仓鼠更快的产生高中和能力的抗血清。
图2 不同变种新冠病毒免疫仓鼠后的抗血清交叉中和能力比较
同时，研究人员尝试去建立这些病毒在不同时间点的抗原图谱，抗血清的中和效价越高，在图谱上和病毒的距离就会越短；而病毒间越接近，则表明它们之间的交叉保护效果会更好。研究人员根据FFRNT抗血清中和能力的检测结果绘制了抗原图谱，不论是抗原还是抗血清，从图谱上都能发现两个聚集群，一个包含了WT，Delta和Epsilon病毒；另一个包含了Alpha+E484K，Beta和Gamma病毒，这两个聚集群内部的病毒相互间具有更好的交叉免疫原性，不同聚集群之间的交叉保护效果则较差。而时序性分析从14天到45天的图谱发现，无论是聚集群内部，还是聚集群之间，随着时间的推移，所有的病毒都在靠拢，相互之间距离越来越短，表明不同变种病毒间的交叉保护效果会伴随免疫时间的延长而逐渐增强（图3）。
图3 不同变种新冠病毒及其抗血清的抗原图谱
最后，在不同变种病毒免疫仓鼠后的第49天，为了去真实评估异种病毒相互之间的交叉保护效果。作者对每一种病毒免疫产生的抗血清，选取了其相对中和能力最差的异种病毒，来进行仓鼠的攻毒实验。每组仓鼠的攻毒剂量都是104PFU/只，攻毒后每天收取其鼻腔洗涤液；在攻毒后的第2天，仓鼠会被处死去解剖肺部和气管；和前面收取的鼻腔洗涤液一起检测其中的活病毒载量。和免疫PBS的对照组相比，所有的病毒免疫组，即使面对抗血清中和效果最差的异种病毒的攻击，都能起到相当的保护效果。保护组的病毒载量在鼻腔液中下降了80到10000倍，在气管中下降950到120000倍，在肺部下降了57000到490000倍（图4a-d）。
图4 不同变种新冠病毒免疫后的病毒攻毒实验
在研究人员完成以上试验后，新冠Omicron变种病毒出现。很多前期实验结果都表明新冠感染和疫苗免疫者的抗血清对Omicron的中和能力都非常差[3]。于是，研究人员使用了当时全球范围内依然大规模流行的两个变种病毒（Delta和Omicron毒株），采用和之前相同的实验思路，进行这两组病毒间的交叉保护和攻毒实验。在感染了Delta和Omicron病毒后，仓鼠的体重均有下降，其中Omicron的症状要轻微的多（图5a）；这一现象和临床上人的感染情况相似。Omicron病毒感染仓鼠的抗血清对Omicron自身的中和能力最高，对Delta和WT的中和能力依次下降。而免疫Delta毒株的仓鼠抗血清对同种Delta毒株中和能力最优，对WT次之，对Omicron最差。后续的攻毒实验结果显示，无论是免疫Delta，还是Omicron毒株的仓鼠，在面对这两种病毒攻击时，都能够降低病毒在不同组织的载量。病毒载量的下降在仓鼠气管和肺部更为明显，在上呼吸道鼻腔中要差的多（图5b-d）。综上，被Delta和Omicron新型变种病毒感染过的人群，再次面对这两种病毒攻击时，也可以获得一定的保护，但其对上呼吸道的保护效果相对较差。
图5 Delta和Omicron毒株感染仓鼠后的体重变化，抗血清交叉中和及攻毒后的交叉保护。
深圳湾实验室传染病研究所刘洋博士，刘建英博士和美国德克萨斯大学医学分部（UTMB）的邹晶博士是该文章的共同第一作者。美国德克萨斯大学医学分部（UTMB）的史佩勇教授和谢旭平助理教授是该文章的共同通讯作者。
结论与展望
虽然现在绝大多数的变种新冠毒株已经销声匿迹，Omicron毒株成为了占绝对地位的新冠流行毒株，但在全球各地依然有着大量被不同新冠变异毒株感染过的人群。在这项研究中，研究人员通过USA-WA1/2020的病毒骨架，携带不同变种病毒的刺突蛋白，使用仓鼠动物模型，系统性评估了不同变种病毒免疫后产生的抗血清对同种/异种病毒的交叉中和及保护效果。但需要指出的是，该研究为了让实验结果相互之间的可比性更强，排除非刺突蛋白区域对实验结果的影响，所有的变种病毒均使用了野生型WT病毒骨架，并不是真实完整的病毒，其抗原图谱可能会和真实世界中的情况有一定的差别。该研究使用仓鼠动物模型攻毒产生的抗血清，没有使用当前各国已经推广应用的商用疫苗免疫后的血清，或不同病毒感染康复者的血清，是为了能在遗传背景均一的实验条件下“Head to head”直接比较各变种病毒刺突蛋白对体液免疫的影响。另外，该研究并没有分析仓鼠包括T细胞免疫在内的其它免疫反应的变化。相对于体液免疫，T细胞表位的针对不同的变种病毒，其保守性要高很多；而使用同样的WT病毒骨架，也降低变种病毒诱发其它免疫反应时产生差别的可能[4]。除去这些小的不足，这项研究系统的在仓鼠模型上揭示了不同变种新冠病毒之间的交叉中和及保护的效果，为新冠疫苗的研发和改进提供了重要信息，并为不同变种新冠病毒感染人群后续的疫苗接种策略和不同地域的新冠防控策略的选择提供依据。
参考文献
[1] Xie, X., et al. An Infectious cDNA Clone of SARS-CoV-2. Cell Host Microbe 27, 841-848 e843 (2020).
[2] Smith, D. J. et al. Mapping the antigenic and genetic evolution of influenza virus. Science 305, 371–376 (2004).
[3] Liu, Y., Liu, J. & Shi, P. Y. SARS-CoV-2 variants and vaccination. Zoonoses (Burlingt) 2, 6 (2022).
[4] Redd, A. D. et al. Minimal crossover between mutations associated with Omicron variant of SARS-CoV-2 and CD8(+) T-cell epitopes identified in COVID-19 convalescent individuals. mBio 13, e03617–e03621 (2022).
论文标题：
Cross-neutralization and cross-protection among SARS-CoV-2 viruses bearing different variant spikes
文章来源 | 刘洋课题组
编辑 | 鲍 啦
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